花序是植物生殖器官的重要组成部分，其发育过程决定了谷物产量。在玉米等作物中，花序分生组织（meristem）的发育尤其关键，因为它们分化为小穗和花分生组织，最终形成可育的花和籽粒。尽管花序发育的重要性已被广泛认可，但其在细胞水平上的调控机仍不清晰。主要原因在于缺乏特异性的标记基因来区分不同细胞类型，尤其是分生组织细胞。此外，传统的转录组学方法无法提供细胞的空间信息，而单细胞RNA测序（scRNA-seq）虽然能够提供高分辨率的细胞类型信息，但在获取细胞悬浮液的过程中会丢失空间信息。

2024年5月14日，nature plants在线发表了华中农业大学严建兵教授团队联合深圳华大研究院刘欢研究员课题组题为“A spatial transcriptome map of the developing maize ear”的研究文章。研究利用单细胞转录组、空间转录组学技术对玉米雌穗进行测定，不仅能够提供玉米雌穗发育过程中的细胞类型和基因表达的空间分布信息，还能够揭示不同细胞类型之间的功能联系和调控机制。通过鉴定与花序发育相关的基因和调控网络，研究结果有望为玉米产量的遗传改良提供新的靶点和策略，从而推动作物育种技术的发展。

样本：玉米幼穗；

技术：空间转录组：4张切片；单细胞转录组：2个重复；

1. 空间转录组图谱的构建：识别并验证了四种尚未在先前研究中报道的细胞/区域类型

研究者使用Stereo-seq技术对约6mm的玉米雌穗原基进行空间转录组测序，成功构建了高分辨率的空间转录组图谱。使用不同的bin得到聚类结果，确定bin50可以得到一个最好的聚类结果（去除基因数量小于150个的低质量bin），随后将来自同一穗轴的两个相邻切片（#1和#2）的bin50合并后进行分析，UMAP图显示了十二个聚类（图1C），这些聚类在穗轴上的物理分布与之前发表的结果一致。更重要的是，Stereo-seq的聚类在某些区域，尤其是在花序分生组织中，展现出了更具典型性的解剖特征（图1D）。

为了验证Stereo-seq的可靠性，接下来在另外两个穗轴切片（#3和#4）中识别了不同细胞类型的分布，利用bin50的空间信息，确定了每个聚类的物理位置。在比较了四个切片后发现有十种细胞类型（bin50）可以在至少三个切片中重复检测到。接下来分析这些聚类之间的差异表达基因，识别了一系列聚类富集基因和聚类特异性标记基因。超过70%的标记基因在至少三个切片中显示出相同的空间表达模式。

为了进一步验证Stereo-seq的灵敏度和准确性，随机选择了33个通过Stereo-seq识别的标记基因，并进行了mRNA原位杂交实验。这种方法能够验证90%的基因（30/33）的空间表达模式（图1E和1F）。最终除了皮层和髓部，所有其他常见细胞类型都通过mRNA原位杂交得到了验证。重要的是识别并验证了四种尚未在先前研究中报道的细胞/区域类型，包括位于关键区域的细胞类型，如分生组织内部（MI），对应于分生组织中心的细胞；花序分生组织顶端（IMT），代表花序分生组织顶部约4–5层的细胞；以及花序分生组织细胞（IM）。这些结果表明，Stereo-seq能够准确描绘细胞类型的物理分布，并揭示基因的特定表达模式，从而发现以前未被识别的细胞类型。

图1.玉米发育中雌穗的空间转录组图谱

A）左侧，玉米发育中雌穗的扫描电子显微镜图像。右侧，花序分生组织（IM）、小穗对分生组织（SPM）、小穗分生组织（SM）和花分生组织（FM）的特写；B) 左侧，附着在1cm芯片上的玉米6mm发育中雌穗切片的核酸染色。右侧，Stereo-seq流程图：放大的图像显示了每个点的大小以及两个相邻点之间的距离；C) UMAP聚类分析。每个点代表来自#1和#2切片的bin50；D) 在#1和#2切片中识别的细胞类型的分布。IMP，花序分生组织周边；IM，花序分生组织；Vas，维管组织（木质部、韧皮部、维管束鞘）；MB，分生组织基部；AMP，背轴分生组织周边；DLO，确定性侧器官；ME，分生组织表皮；MI，分生组织内部；IMT，花序分生组织顶端；E)mRNA原位杂交 kcs15（3-酮酰辅酶A合成酶15）；(F) mRNA原位杂交ZmZNF30。

2. 单细胞转录组与空间转录组联合分析:构建了玉米雌穗空间特异的基因共表达网络

为了探索发育中玉米雌穗的时空调控网络，进一步对与空间转录组分析相同发育时间点（约6-8mm阶段）的雌穗原基进行了单细胞转录组测序。在移除了原生质体诱导的基因并筛选掉线粒体转录本比例超过5%或表达基因少于1500个的低质量细胞后，检测到14243个细胞和28627个表达基因（UMI>1）。

在进行无监督分析之前使用Harmony算法消除了两个重复样本之间的批次效应。随后通过UMAP图展示了聚类结果，细胞被分为十三个聚类（图2A）。应用STRIDE整合了单细胞转录组和空间转录组数据，STRIDE的预测结果显示，单细胞聚类0、3和4的细胞分布在花序分生组织中，而 1、12和11的细胞主要分布在维管组织、分生组织表皮和分生组织内部（图2B）。利用#3和#4切片的bin50也能得出相同的结论。为了进一步验证整合结果的准确性，使用Seurat的FindAllMarkers函数（最小百分比=0.3，对数2倍变化阈值=0.25，调整后P值<0.01）在scRNA-seq中识别了2864个聚类特异性标记基因，并验证了它们在Stereo-seq数据中的表达模式（图2C）。

为了理解发育中雌穗的基因调控，接下来利用WGCNA构建了基于单细胞转录组数据集的基因共表达网络，识别出12个基因模块，这些模块中的基因在特定细胞类型中高度协调表达。例如，模块3中的基因主要在维管组织中表达，涉及木质素生物合成（图2E）；模块5中的基因在花序分生组织中表达，与碳代谢相关（图2F）；模块7中的基因在分生组织表皮细胞中表达，涉及脂肪酸代谢和角质层合成（图2D）。这些结果表明，同一模块中的基因可能在相同的细胞类型中发挥作用，并与细胞的区域特异性生物学功能相关。

为了进一步研究表达网络中的枢纽基因是否对玉米产量有贡献，研究者对与玉米产量相关的性状（如穗粗、行粒数、穗长等）进行了SNP遗传力分析，核心基因（如调控角质合成的OCL5、木质素合成的漆酶基因、分生组织中的nactf25）的SNP遗传力分析显示，这些基因与玉米穗形态性状（穗长、行粒数等）显著相关，为分子育种提供了新靶点。

图2.scRNA-seq和Stereo-seq数据构建空间共表达网络

A) UMAP聚类图，每个点代表一个细胞；B) 显示了不同单细胞聚类（Sc-cluster）的细胞在空间转录组位点中的比例；C) 上方，标记基因的UMAP图，图中的数字表示该基因是相应单细胞聚类（Sc-cluster）的标记基因。下方，相同基因的UMAP图，图中的数字表示该基因是相应聚类的标记基因，颜色尺度表示在#1和#2切片的Stereo-seq中的标准化表达水平；D-F) 基因模块3（D）、5（E）和7（F）的共表达网络；G) 在#1和#2切片中，模块3、5和7的三个枢纽基因的空间可视化。

3. 发育轨迹的解析：雌穗发育主要包含垂直发育和侧向分化两条主要轨迹

凭借细胞类型的确切位置信息，基于解剖结构构建了发育中雌穗的发育轨迹。利用Monocle2进行伪时间分析，并在“分叉”轨迹中发现了七个状态（图3A和3B）。处于状态4、5和6的bin50主要位于髓部、皮层和维管组织，而处于状态1、2和7的bin50主要位于花序分生组织、花序分生组织顶端、分生组织表皮和分生组织内部（图3C）。随后进行了RNA速度分析以确认细胞分化的轨迹。在伪时间路径上观察到两条主要的轨迹（图3D）：（i）垂直分化：从分生组织表皮细胞向分生组织基部的分化；（ii）侧向分化：从维管组织上层细胞向原基基部的分化。

图3.玉米6mm雌穗的发育轨迹

A) 使用#1和#2切片的bin50进行伪时间分析；B) #1和#2切片的bin50的伪时间阶段；C) 主要位于穗轴和小花的bin50在伪时间轨迹分支上的分布；D) RNA速度分析显示玉米6mm雌穗的预测发育轨迹。bin50根据基于矢量场的伪时间得分进行着色，并定位在与图1D相同的坐标中。

4.关键基因的鉴定和功能验证：和在控制花序干细胞分化为确定性花分生组织中具有冗余且关键的功能

接下来为进一步了解干细胞的确定性是如何从不确定的花序分生组织转移到更为确定的小穗和花分生组织的。从小穗分生组织和花分生组织中提取了不确定性和确定性分生组织的bin50，从切片#1中获得了1182个bin50，从切片#2中获得了1394个bin50，并对它们进行了重新聚类，产生了三个亚聚类（图4A）。这些亚聚类明显分布在不同的发育区域，包括不确定的花序分生组织顶端（IMT）、确定性小穗/花分生组织周边（DMP）和确定性小穗/花分生组织顶端（DMT）。这些结果表明，重新聚类可以根据它们的表达谱分离高度相似的干细胞类型，为研究在穗发育过程中调控干细胞命运的基因表达变化提供了机会。

随后进行了比较分析，以挖掘可能调控干细胞确定性的潜在调控因子。其中包括两个MADS-box基因，及其同源基因（图4B），它们在Stereo-seq中特异性表达于确定性小穗/花分生组织顶端，并通过mRNA原位杂交验证了它们的表达模式（图4C和4D）。通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术生成了和的双敲除突变体。单突变体发育正常，能够产生正常的小穗和可育的花。在CR-Zmmads8/14双突变体中，植物形态与野生型没有显著差异，花序和小穗分生组织发育正常。然而，花分生组织被转化为不确定性的穗轴分枝。这表明和是将干细胞身份转变为花分生组织的关键调控因子（图4E-4P）。结果表明，和在玉米雌穗发育过程中，将多能干细胞分化为确定性花分生组织的过程中发挥着关键作用。Stereo-seq生成的空间转录组为作物花序发育提供了新的见解，并促进了对精细发育过程背后关键调控因子的识别。

图4.ZmMADS8和ZmMADS14参与干细胞分化

A）左侧，提取分布在分生组织表皮和花序分生组织顶端的bin50 UMAP聚类。右侧，#1切片上3个亚聚类的bin50的物理分布；B) 14个参与玉米雌穗发育且在确定性分生组织顶端高表达的基因热图；C-D) mRNA原位杂交（C）和（D）；E-H) 野生型（E）、（F）、（J）和（H）的雌穗表型；I-L) 野生型（I）、（J）、（K）和（L）的雌花表型；M-P) 野生型（M）、（N）、（O）和（P）的花序分生组织的扫描电子显微镜图像

1.首次将Stereo-seq技术成功应用于玉米复杂器官（雌穗）的空间转录组研究，克服了植物细胞液泡化对空间组学的技术限制。

2.揭示了分生组织内部的细胞异质性及关键调控网络，为解析作物产量形成的分子机制提供了高精度数据资源。

3.鉴定了ZmMADS8/14等新调控因子，为通过基因编辑优化穗部结构、提高产量提供了理论依据。