【查找证书】

在微生物学的广阔领域中，细菌的分类与鉴定是基础而关键的一环。这不仅关乎我们对细菌多样性的理解，还直接影响到疾病的诊断、治疗以及公共卫生措施的制定。在众多细菌分类方法中，革兰染色法以其简便、快速、高效的特点，成为了细菌学实验室中最常用的初步分类手段之一。本文将深入探讨革兰染色法的原理、操作步骤、结果解读及其在细菌分类中的关键作用，旨在为读者提供一个全面而深入的理解。

一、革兰染色法的原理

1. 细菌细胞壁的结构差异

革兰染色法的核心在于利用细菌细胞壁结构的差异进行区分。细菌细胞壁主要由肽聚糖层构成，但革兰氏阳性菌（G⁺菌）和革兰氏阴性菌（G⁻菌）在肽聚糖层的厚度、组成以及外层结构上存在显著差异。G⁺菌的肽聚糖层较厚，且含有较多的磷壁酸或脂磷壁酸；而G⁻菌的肽聚糖层较薄，外层则被一层外膜所包裹，这层外膜主要由脂多糖、脂质A和蛋白质组成。

2. 染色剂的化学特性

革兰染色法使用的染色剂包括结晶紫、碘液、95%乙醇和番红（或沙黄）。结晶紫是一种碱性染料，能够初步染色所有细菌；碘液则作为媒染剂，增强结晶紫与细菌的结合力。随后，使用95%乙醇进行脱色处理，这是革兰染色法的关键步骤。由于G⁺菌细胞壁结构紧密，肽聚糖层厚且交联程度高，乙醇难以穿透，因此结晶紫-碘复合物不易被洗脱，保持紫色；而G⁻菌的细胞壁结构较为疏松，乙醇能够轻易穿透，将结晶紫-碘复合物洗脱，使细菌呈现无色或浅色。最后，用番红（或沙黄）复染，G⁻菌被染成红色，而G⁺菌因已牢固着色，不再接受番红的染色，保持紫色。

二、革兰染色法的操作步骤

1. 涂片与固定

取适量细菌悬液均匀涂布于干净的载玻片上，形成薄而均匀的菌膜。

将涂片置于火焰上方微微加热固定，以杀死细菌并使其附着于玻片上，防止在染色过程中被水冲走。

2. 初染

用结晶紫染色1-2分钟，使细菌初步着色。

3. 媒染

用碘液冲洗涂片，媒染1分钟，增强结晶紫与细菌的结合力。

4. 脱色

用95%乙醇脱色30秒至1分钟，此步骤是区分G⁺菌和G⁻菌的关键。

5. 复染

用番红（或沙黄）复染30秒至1分钟，使未被脱色的G⁺菌保持紫色，而被脱色的G⁻菌染成红色。

6. 镜检

在显微镜下观察涂片，根据细菌的颜色判断其革兰属性。

三、革兰染色法的结果解读

1. 革兰氏阳性菌（G⁺菌）

呈现紫色或蓝紫色，细胞形态多样，包括球菌、杆菌等。

常见种类有大肠埃希菌以外的肠杆菌科细菌、葡萄球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属等。

2. 革兰氏阴性菌（G⁻菌）

呈现红色，细胞形态同样多样。

常见种类有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌等。

3. 注意事项

染色过程中应注意控制染色时间和脱色强度，避免过度或不足导致结果误判。

某些特殊细菌（如奈瑟菌属、莫拉菌属等）可能因细胞壁结构特殊，难以准确分类，需结合其他方法综合判断。

四、革兰染色法在细菌分类中的关键作用

1. 初步分类与鉴别诊断

革兰染色法能够快速地将细菌分为G⁺菌和G⁻菌两大类，为后续的细菌鉴定提供重要线索。

在临床微生物学实验室中，革兰染色法是初步鉴别细菌种类、指导抗生素选择的重要手段。

2. 指导抗生素治疗

G⁺菌和G⁻菌对抗生素的敏感性存在差异。例如，青霉素类抗生素对G⁺菌有效，而对G⁻菌通常无效；而氨基糖苷类抗生素则对G⁻菌有较好的杀菌作用。因此，革兰染色法的结果有助于选择合适的抗生素进行治疗。

3. 流行病学监测与公共卫生

在流行病学监测中，革兰染色法可用于快速识别致病菌的种类和传播趋势，为公共卫生决策提供科学依据。

例如，在食物中毒事件中，通过革兰染色法可初步判断致病菌的种类，为后续的实验室检测和防控措施提供指导。

4. 科研与教学

在微生物学教学和科研中，革兰染色法是基础实验之一，有助于培养学生掌握细菌分类和鉴定的基本技能。

通过革兰染色法，科研人员可以研究细菌细胞壁的结构和功能，探索细菌耐药性的机制等。

五、总结与展望

革兰染色法作为一种经典而实用的细菌分类方法，在微生物学领域发挥着不可替代的作用。它不仅为细菌的快速分类和鉴别诊断提供了有力工具，还指导了抗生素的合理选择，为公共卫生决策提供了科学依据。随着科技的进步和微生物学研究的深入，革兰染色法也在不断完善和发展。例如，结合荧光染色、自动化仪器等新技术，革兰染色法的准确性和效率得到了进一步提升。未来，我们有理由相信，革兰染色法将在细菌分类和鉴定中发挥更加重要的作用，为人类健康和公共卫生事业做出更大的贡献。

新郑天佑医院（原新郑市第二人民医院）检验科主管检验师 陈英赢